Tabla 1. Resultados de concentración de radicales libres (ROS) en los grupos tratados con y sin N-...

Tabla 2. Resultados de concentración de creatinina en suero en grupos tratados con y sin N-acetilc...

Tabla 3. Modelo multivariable para evaluar relación de diferentes factores con la insuficiencia re...

Figura 1. Diagrama de flujo que explica la división de grupos.

Introducción

La sepsis es un estado patológico, donde está activada toda la cascada inflamatoria y se desencadenan múltiples procesos fisiopatológicos capaces de producir daño celular. Uno de esos procesos es la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS); de hecho, distintos trabajos han demostrado el aumento de la concentración de ROS en distintos tejidos durante la sepsis1,2.

Hay distintas definiciones para el estrés oxidativo, pero la más común y descripta es el desbalance entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la capacidad antioxidante celular que, potencialmente, puede dañar células y destruir tejidos3. La presencia de ROS en las células es normal, y de hecho cumplen un rol de señalización intracelular en la fisiología normal4,5.

Las especies reactivas de oxígeno son un grupo de moléculas que incluyen radicales de oxígeno, como el superóxido (O2•–), hidroxilo (OH•), peroxilo (RO2•) y alcoxilo (RO•), así como no radicales que son agentes oxidantes o se convierten rápidamente en radicales como el ácido hipocloroso (HOCl), oxígeno singlete (1O2) y peróxido de hidrógeno (H2O2)4. Por otro lado, también hay especies reactivas de nitrógeno (RNS), tanto radicales como no radicales, como el óxido nítrico (NO), el peroxinitrito (ONOO–) y el dióxido de nitrógeno (NO2•)5,6.

Los ROS son producidos principalmente en la mitocondria donde la cadena de transporte de electrones es la principal productora7. También hay fuentes extramitocondriales de ROS8,9. Asimismo, la célula tiene distintos mecanismos para amortiguar la presencia de estos ROS y mitigar así el daño9. Cuando estos mecanismos de defensa son sobrepasados, deviene el daño oxidativo6,9. Los ROS tienen vida media efímera y poco se sabe sobre la presencia y los efectos que tienen los ROS en suero o ROS sistémicos y su posible rol fisiopatológico.

Es sabido que la causa más común de insuficiencia renal en terapia intensiva es la sepsis10. Una de las posibles causas de la lesión celular a nivel renal, que lleva a la disminución de la función, es la producción de ROS10.

Se ha propuesto el uso de distintas drogas para disminuir la presencia de ROS. Una de las más estudiadas es la N-acetilcisteína (NAC). Esta droga tiene distintas indicaciones, entre ellas, el tratamiento de la intoxicación con paracetamol11,12, la prevención de la nefropatía por contraste13, tratamiento de distintas patologías respiratorias14 y distintos trastornos psiquiátricos como esquizofrenia y adicciones15.

El objetivo de este trabajo consistió en explorar la relación entre la falla renal inducida por sepsis, los ROS sistémicos y su posible prevención con NAC, en un modelo animal de laboratorio. Las ventajas del modelo animal consisten en que se pueden controlar variables, ya que, en los distintos trabajos en pacientes sépticos, las poblaciones son muy heterogéneas.

Materiales y métodos

Animales

Se usaron 64 ratas Sprague Dawley de 8 semanas con ambientación de 4 semanas y 6 semanas, cuyos pesos se encontraban entre 300 y 400 g. Los animales estuvieron expuestos a ciclos de luz de 12 horas y fueron alimentados ad libitum. El uso de los animales fue aprobado por el CICUAL (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Experimentación) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires (EXP-UBA: 02282/2012).

Se utilizaron dos grupos de animales, uno sin premedicar y otro premedicado con N-acetilcisteína. Al grupo tratado se le administraron 150 mg/kg de N-acetilcisteína por vía intraperitoneal dos horas antes de la intervención quirúrgica, para inducir sepsis. A su vez, cada grupo se dividió en 4 subgrupos: subgrupo control (sin intervención quirúrgica), subgrupo con laparotomía simple, subgrupo con sepsis (punción y ligadura cecal), y subgrupo con sepsis seguida de reanimación con fluidos y antibióticos (Figura 1). Cada subgrupo estuvo constituido por 8 ratas.

Inducción de sepsis

La inducción de sepsis se realizó mediante punción cecal y ligadura de ciego, según técnica descripta en bibliografía16,17. Para ello, se practicó una laparotomía mediana, se identificó el ciego, se ligaron 2 cm de este y, posteriormente, se realizó punción con aguja 20x8 G en ambas caras. Posteriormente, se realizó sutura por planos.

Solución de NAC

Se preparó una solución que contenía 60 mg/ml de NAC (Laboratorios Casasco). El polvo se resuspendió en agua destilada. La solución se esterilizó mediante filtración a través de un filtro de 0.2 µm (Ministart®) bajo una campana de flujo laminar.

Reanimación con fluidos y antibióticos

Consistió en suministrar por vía intraperitoneal, inmediatamente después de la cirugía, 25 ml/kg de solución de NaCl 0.9% p/v, ceftriaxona 30 mg/kg y clindamicina 25 mg/kg. El esquema antibiótico fue elegido para cubrir el espectro de bacterias Gram negativas y anaerobias.

Obtención de las muestras

A las 24 horas de realizado el procedimiento correspondiente a cada grupo, se extrajo una muestra de sangre por punción cardíaca y las ratas fueron sacrificadas. La sangre se centrifugó a 3000 rpm, se tomó el suero, el cual fue congelado a –75°C, hasta realizar las determinaciones correspondientes.

Medición de ROS en el suero

Se efectuó mediante la utilización de diclorofluoresceína-diacetato (DCFH). Se incubaron 12 µl de suero por 10 minutos, en 1000 µl de buffer TE y se agregaron 10 µl de NaOH, para escindir el diacetato y así activar la diclorofluoresceína. La fluorescencia emitida se midió en equipo Jasco FP770. Con cada muestra se realizó un espectro de emisión entre 500 y 550 nm. El valor expresado es el de la emisión a 525 nm.

Medición de creatinina sérica

Se utilizó la técnica de química seca. Los valores están expresados en mg/dl.

Análisis estadístico de los datos

Se utilizó el software STATA 11.0. Para comparar medias se realizó test de Student (2 subgrupos) o ANOVA a 1 vía (4 subgrupos). Posteriormente, al analizar la función renal, el criterio aplicado para dividir la población de animales en un grupo con deterioro de la función renal y otro sin deterioro de la función renal fue el punto de corte de 0.68 mg/dl, ya que este valor divide a la población en dos mitades iguales, con mayor y menor nivel de creatinina. Para analizar la correlación entre los niveles de ROS y creatinina se utilizó la correlación de Pearson. Posteriormente se realizó regresión logística múltiple. Se ingresaron las siguientes variables independientes dicotómicas: el peso de las ratas mayor a 350 gramos, la presencia de laparotomía, punción cecal, el uso de antibiótico, la administración de NAC y los niveles de ROS mayor a 0.11, medidos por emisión de DCFH. Se consideró significativo un valor de p< 0.05.

Resultados

Los valores de ROS medidos por grupo (grupo sin NAC vs. grupo con NAC) y subgrupos se presentan en la c 1 (Tabla 1). Al analizar las diferencias de los niveles de ROS entre el grupo sin NAC y el grupo con NAC, no hubo diferencias significativas (p=0.1). Se observó, en el grupo sin NAC, que la producción de ROS séricos fue mayor con la laparotomía y aún mayor en el subgrupo con sepsis, siendo el aumento de 34.19% y 57.28%, respectivamente. El subgrupo con sepsis y reanimación presentó menores niveles séricos de radicales libres con respecto al subgrupo con sepsis no reanimado, pero mayores que el subgrupo control (40.24%). No hubo diferencias significativas entre los subgrupos del grupo sin NAC (p=0.27). En el grupo con NAC, no hubo diferencias significativas entre subgrupos, en los niveles de ROS séricos (p=0.73). A su vez, no hubo diferencias entre los subgrupos pareados que no fueron tratados con NAC y aquellos que fueron tratados.

Por otra parte, al comparar las medias de los niveles séricos de creatinina (Tabla 2) entre el grupo con NAC y sin NAC, se observaron diferencias significativas (p< 0.001). En el grupo sin NAC, se observaron niveles séricos de creatinina mayores en el subgrupo laparotomía (17.5%) y en el subgrupo con sepsis (50%) en comparación con el subgrupo control. El análisis de los valores medidos en estos subgrupos del grupo sin NAC arroja diferencias significativas (p=0.003). En el grupo tratado con NAC, la laparotomía aumentó los niveles de creatinina un 46.55%. Los animales del subgrupo con sepsis tuvieron un aumento del 60.34%; y, a su vez, los animales sépticos reanimados presentaron un aumento del 51.57%. Las diferencias entre los subgrupos fueron significativas (p=0.0019). Al analizar los distintos subgrupos, aquellos que fueron tratados con NAC presentan mayores niveles de creatinina que aquellos que no fueron tratados con NAC. Estas diferencias son significativas en los subgrupos control (p=0.016), laparotomía (p< 0.001) y sepsis (p=0.023).

Al analizar la relación entre los niveles de DCFH y creatinina se realizó la correlación de Pearson, r=0.29, (p=0.013).

Se construyó un modelo de regresión logística múltiple, en el cual se dicotomizaron los valores de creatinina en 0.68 mg/dl, y, de esta forma, se divide la población de animales en 2 mitades iguales. El resultado de la regresión logística se expresa en la (Tabla 3). Se observa que NAC es el único factor que tiene una relación estadísticamente significativa con el aumento de creatinina (p< 0.001).

Discusión

La sepsis es la causa más común de falla renal en terapia intensiva10. En este trabajo se ha estudiado los niveles de los ROS en suero producidos en la sepsis, posible influencia en el desarrollo de la falla renal y su posible tratamiento con NAC en ratas. Dado que la correlación de Pearson da r=0.29 (p=0.013), se puede afirmar que no hay relación entre los niveles de ROS sistémicos y los niveles de creatinina. Esta correlación se realizó en la población total de ratas, por lo que el resultado es independiente del tratamiento con NAC.

Se ha observado que la administración de 150 mg/kg de NAC intraperitoneal no disminuye los niveles de ROS. Además, esta misma dosis aumenta los niveles de creatinina de forma significativa. Al analizar la influencia de distintos factores que pueden ser desencadenantes de la falla renal, mediante regresión logística múltiple, la NAC fue el único factor positivo (odds ratio [OR]=26.24; p< 0.001). Ante esta observación, se podría pensar que no hay relación entre los niveles de ROS sistémicos y el deterioro de la función renal, aunque para asegurar esto se necesitan estudios más detallados.

Numerosas publicaciones usan ratas con punción cecal como modelo de sepsis, utilizando diferentes dosis de NAC y vías de administración, ya sea vía oral con sonda18,19, en el agua que bebían dos días antes de la cirugía1, o en forma subcutánea en repetidas dosis antes de la cirugía20. En el actual trabajo se decidió usar la dosis de 150 mg/kg vía intraperitoneal, usada en varías publicaciones21,22, dado que se la consideró una vía de administración segura y exacta. En estas publicaciones no se evaluó la función renal, sino solamente parámetros relacionados con el estrés oxidativo. En un trabajo realizado por Campos1 se evaluó el filtrado glomerular mediante clearance de inulina, el cual mejoró con la administración de NAC, pero la dosis utilizada fue menor que la del presente trabajo y la vía de administración fue distinta.

Cabe también destacar que la dosis recomendada de NAC por distintos trabajos para la intoxicación por paracetamol es un bolo de 150 mg/kg, seguido por distintos regímenes de infusión continua endovenosa11,12,23.

También hay trabajos con líneas celulares, donde la administración de NAC, disminuye la reducción de ROS mediada por lipopolisacáridos, medidos con la técnica de DCFH24. Pero esto es una línea celular, con una dosis de 1 mM de NAC, es decir que son dosis distintas y modelos distintos.

En este trabajo se ha observado que la NAC deteriora la función renal de las ratas sépticas, no así en los animales control. Distintos trabajos han mostrado la utilidad de la NAC en patologías como la intoxicación con paracetamol11,12, prevención de la nefropatía por contraste13, patologías respiratorias14 y distintos trastornos psiquiátricos como esquizofrenia y adicciones15. Específicamente, en sepsis hay distintos trabajos en los cuales se evalúa mortalidad, y en 2012 un metaanálisis de la Colaboración Cochrane25, en el cual no se observó reducción de la mortalidad, tiempo de estadía, duración de la ventilación mecánica o aparición de nuevas fallas orgánicas, reportó, sin embargo, que la administración tardía de la NAC está asociada con inestabilidad cardiovascular25. Diversas publicaciones han demostrado que la NAC disminuye la producción de ROS en los tejidos y a su vez la NAC es usada como medida para la prevención de nefropatía por contraste, si bien su uso es discutido.

Hay reportes que informan distintos efectos adversos de esta droga, cuya severidad varía entre las náuseas hasta la muerte de pacientes, siendo la intolerancia digestiva y las reacciones anafilácticas las más comunes26. Además, se han reportado alteraciones electrocardiográficas, en el coagulograma, y status epiléptico26. Las reacciones adversas son más comunes vía parenteral que enteral y se relacionan también con la magnitud de la dosis11,26.

A su vez, Mant y colaboradores27 publicaron un reporte de efectos adversos asociados al uso de NAC, entre los cuales se encuentran hipotensión y falla renal, siendo estas las posibles causas del deterioro de la función renal encontrada en nuestro trabajo. La revisión de 2012 de la Colaboración Cochrane25, mencionada anteriormente, también reporta inestabilidad cardiovascular en la administración tardía de la NAC, pudiendo ser esta otra de las causas de deterioro de la función renal. Por otro lado, Spapen y cols.28 en 2005, publicaron un reporte preliminar en el cual se les administraba a pacientes con sepsis severa NAC endovenoso. En el trabajo reporta que no hubo diferencias en el índice microalbuminuria/creatinina entre los pacientes que recibieron NAC y aquellos que recibieron placebo, además empeoró el score SOFA (Sequential Organ Failure Assessment) a las 48 horas de ingreso de los pacientes que recibieron NAC, esto asociado a una mayor falla cardiovascular.

Si bien el uso de creatinina para determinar la falla renal aguda es un concepto que quedó relegado ante la presencia de nuevos marcadores como N-GAL29, el cual todavía no se usa de manera rutinaria30,31, este trabajo tiene el interés de haber analizado la influencia de la NAC en la falla renal en sepsis. Se necesitan más investigaciones que analicen la falla renal con otros marcadores o con distintas dosis y vías de administración de NAC en la sepsis. Por otra parte, si bien la diclorofluoresceína-diacetato32 es discutida como marcador de ROS, en diversas publicaciones se ha usado con éxito33,34. En nuestro laboratorio se ha demostrado con curvas de titulación con H2O2, y realizando espectrofotometrías que es un marcador confiable para la medición de ROS (datos no publicados), y los niveles de ROS en el modelo utilizado en este trabajo se elevan de acuerdo a lo previsto.

Para concluir, tomando en cuenta los resultados presentados, en este trabajo se aspiró a relacionar los niveles de ROS sistémicos, la falla renal, una de las fallas orgánicas más frecuentes en la sepsis, y el posible tratamiento con NAC. Los resultados obtenidos no indican una disminución de los niveles de ROS sistémicos ni tampoco una mejoría en la función renal con NAC. Por el contrario, se ha observado mayor deterioro de la función renal luego de la administración de la NAC, siendo este un efecto adverso descripto, aunque poco habitual asociado a la droga, y nunca analizado en contexto de sepsis. Probablemente esto se deba a la dosis y a la vía de administración de la droga. Se necesitan más investigaciones para aclarar el rol de la NAC en la falla renal inducida por sepsis.

1. Campos R, Shimizu MH, Volpini RA, et al. N-acetylcysteine prevents pulmonary edema and acute kidney injury in rats with sepsis submitted to mechanical ventilation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2012;302(7):L640-50.

2. Andrades M, Ritter C, de Oliveira MR, Streck EL, Fonseca Moreira JC, Dal-Pizzol F. Antioxidant treatment reverses organ failure in rat model of sepsis: role of antioxidant enzymes imbalance, neutrophil infiltration, and oxidative stress. J Surg Res 2011;167(2):e307-13.

3. Preiser JC. Oxidative stress. JPEN J Parenter Enteral Nutr 2012;36(2):147-54.

4. Russell EG, Cotter TG. New Insight into the Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cellular Signal-Transduction Processes. Int Rev Cell Mol Biol 2015;319:221-54.

5. Andrades MÉ, Morina A, Spasic S, Spasojevic I. Bench-to-bedside review: sepsis - from the redox point of view. Crit Care 2011;15(5):230.

6. Berg RM, Møller K, Bailey DM. Neuro-oxidative-nitrosative stress in sepsis. J Cereb Blood Flow Metab 2011;31(7):1532-44.

7. Taylor DE, Ghio AJ, Piantadosi CA. Reactive oxygen species produced by liver mitochondria of rats in sepsis. Arch Biochem Biophys 1995;316(1):70-6.

8. Bayir H. Reactive oxygen species. Crit Care Med 2005;33(12 Suppl):S498-501.

9. Fink MP. Reactive oxygen species as mediators of organ dysfunction caused by sepsis, acute respiratory distress syndrome, or hemorrhagic shock: potential benefits of resuscitation with Ringer’s ethyl pyruvate solution. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2002;5(2):167-74.

10. Zarbock A, Gomez H, Kellum JA. Sepsis-induced acute kidney injury revisited: pathophysiology, prevention and future therapies. Curr Opin Crit Care 2014;20(6):588-95.

11. Kanter MZ. Comparison of oral and i.v. acetylcysteine in the treatment of acetaminophen poisoning. Am J Health Syst Pharm 2006;63(19):1821-7.

12. Whyte IM, Francis B, Dawson AH. Safety and efficacy of intravenous N-acetylcysteine for acetaminophen overdose: analysis of the Hunter Area Toxicology Service (HATS) database. Curr Med Res Opin 2007;23(10):2359-68.

13. Weisbord SD, Gallagher M, Kaufman J, et al. Prevention of contrast-induced AKI: a review of published trials and the design of the prevention of serious adverse events following angiography (PRESERVE) trial. Clin J Am Soc Nephrol 2013;8(9):1618-31.

14. Tse HN, Tseng CZ. Update on the pathological processes, molecular biology, and clinical utility of N-acetylcysteine in chronic obstructive pulmonary disease. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 2014;9:825-36.

15. Berk M, Malhi GS, Gray LJ, Dean OM. The promise of N-acetylcysteine in neuropsychiatry. Trends Pharmacol Sci 2013;34(3):167-77.

16. Doi K, Leelahavanichkul A, Yuen PS, Star RA. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest 2009;119(10):2868-78.

17. Toscano MG, Ganea D, Gamero AM. Cecal ligation puncture procedure. J Vis Exp 2011;(51):2860.

18. Gül M, Ayan M, Seydanoglu A, et al. The effect of N-acetyl cysteine on serum glutathione, TNF-alpha and tissue malondialdehyde levels in the treatment of sepsis. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg 2011;17(4):293-7.

19. Barreiro E, Sánchez D, Gáldiz JB, Hussain SN, Gea J; ENIGMA in COPD project. N-acetylcysteine increases manganese superoxide dismutase activity in septic rat diaphragms. Eur Respir J 2005;26(6):1032-9.

20. Ritter C, Andrades ME, Reinke A, Menna-Barreto S, Moreira JC, Dal-Pizzol F. Treatment with N-acetylcysteine plus deferoxamine protects rats against oxidative stress and improves survival in sepsis. Crit Care Med 2004;32(2):342-9.

21. Casarin AL, Lopes-Pires ME, Morganti RP, Antunes E, Marcondes S. Reactive oxygen and nitrogen species modulate the ex-vivo effects of LPS on platelet adhesion to fibrinogen. Life Sci 2011;89(21-22):773-8.

22. Gülbahar O, Arikök AT, Kulaçoglu H, Aydin R. Tissue oxidative stress level and remote organ injury in two-hit trauma model of sequential burn injury and peritoneal sepsis are attenuated with N-acetylcysteine treatment in rats. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg 2009;15(1):1-6.

23. Green JL, Heard KJ, Reynolds KM, Albert D. Oral and Intravenous Acetylcysteine for Treatment of Acetaminophen Toxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. West J Emerg Med 2013;14(3):218-26.

24. Chuang CY, Chen TL, Cherng YG, Tai YT, Chen TG, Chen RM. Lipopolysaccharide induces apoptotic insults to human alveolar epithelial A549 cells through reactive oxygen species-mediated activation of an intrinsic mitochondrion-dependent pathway. Arch Toxicol 2011;85(3):209-18.

25. Szakmany T, Hauser B, Radermacher P. N-acetylcysteine for sepsis and systemic inflammatory response in adults. Cochrane Database Syst Rev 2012;2012(9):CD006616.

26. Sandilands EA, Bateman DN. Adverse reactions associated with acetylcysteine. Clin Toxicol (Phila) 2009;47(2):81-8.

27. Mant TG, Tempowski JH, Volans GN, Talbot JC. Adverse reactions to acetylcysteine and effects of overdose. Br Med J (Clin Res Ed) 1984;289(6439):217-9.

28. Spapen HD, Diltoer MW, Nguyen DN, Hendrickx I, Huyghens LP. Effects of N-acetylcysteine on microalbuminuria and organ failure in acute severe sepsis: results of a pilot study. Chest 2005;127(4):1413-9.

29. Haase-Fielitz A, Haase M, Devarajan P. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a biomarker of acute kidney injury: a critical evaluation of current status. Ann Clin Biochem 2014;51(Pt 3):335-51.

30. Peacock WF 4th, Maisel A, Kim J, Ronco C. Neutrophil gelatinase associated lipocalin in acute kidney injury. Postgrad Med 2013;125(6):82-93.

31. Mårtensson J, Bellomo R. The rise and fall of NGAL in acute kidney injury. Blood Purif 2014;37(4):304-10.

32. LeBel CP, Ischiropoulos H, Bondy SC. Evaluation of the probe 2’,7’-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress. Chem Res Toxicol 1992;5(2):227-31.

33. Tominaga H, Katoh H, Odagiri K, et al. Different effects of palmitoyl-L-carnitine and palmitoyl-CoA on mitochondrial function in rat ventricular myocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008;295(1):H105-12.

34. Valkonen M, Kuusi T. Spectrophotometric assay for total peroxyl radical-trapping antioxidant potential in human serum. J Lipid Res 1997;38(4):823-33.

Para descargar el PDF del artículo
N-acetilcisteína eleva los niveles de creatinina sin disminuir las especies reactivas de oxígeno en ratas sépticas

Haga click aquí